Il fegato RBFOX2 regola l'omeostasi del colesterolo tramite lo splicing alternativo Scarb1 nei topi

Nature Metabolism volume 4, pagine 1812–1829 (2022)Citare questo articolo

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Lo splicing alternativo dell'RNA (AS) espande il potenziale normativo dei genomi eucariotici. I meccanismi che regolano i profili AS specifici del fegato e il loro contributo alla funzionalità epatica sono poco conosciuti. Qui, identifichiamo un ruolo chiave per la proteina Fox 2 (RBFOX2) del fattore di splicing che lega l'RNA nel mantenimento dell'omeostasi del colesterolo in un ambiente lipogenico nel fegato. Utilizzando la reticolazione ultravioletta e l'immunoprecipitazione potenziate con risoluzione dei singoli nucleotidi, identifichiamo obiettivi fisiologicamente rilevanti di RBFOX2 nel fegato di topo, incluso il recettore scavenger di classe B di tipo I (Scarb1). La funzione RBFOX2 è ridotta nel fegato nell'obesità indotta dalla dieta, causando un cambiamento dell'isoforma Scarb1 e un'alterazione dell'omeostasi lipidica degli epatociti. I nostri risultati dimostrano che specifici programmi di AS mantengono attivamente la fisiologia del fegato e sono alla base degli effetti lipotossici delle diete obesogene quando disregolate. Gli oligonucleotidi di commutazione di giunzione mirati a questa rete alleviano l’infiammazione indotta dall’obesità nel fegato e promuovono un profilo lipoproteico anti-aterogenico nel sangue, sottolineando il potenziale delle terapie a RNA isoforma-specifiche per il trattamento delle malattie associate al metabolismo.

Nei mammiferi, la maggior parte dei geni multi-esone subiscono AS, generando più isoforme1,2 e contribuendo alla complessità della trascrizione3. Si ritiene che l'AS sia fondamentale per la creazione e il mantenimento di reti di interazione proteica tessuto-specifiche4,5,6 e dell'identità tissutale6. È meno chiaro se specifici programmi AS regolino l’adattamento fisiologico e il loro ruolo nella malattia metabolica non è chiaro, a causa della scarsa caratterizzazione funzionale di isoforme specifiche e delle sfide tecniche coinvolte nell’identificazione di specifici fattori di splicing regolatori a monte in vivo. Pertanto, esistono informazioni limitate sulle reti di splicing coinvolte nella riprogrammazione metabolica, sia a livello dei fattori di splicing che delle isoforme che regolano. Oltre ad aumentare la nostra conoscenza sulla regolazione metabolica in condizioni di salute e malattia, la caratterizzazione dei fattori di splicing e delle isoforme coinvolte nella regolazione metabolica potrebbe portare allo sviluppo di terapie basate sull’RNA per modulare isoforme specifiche. Le terapie basate sull'RNA per inattivare geni specifici nel fegato stanno emergendo come strategie terapeutiche promettenti per le patologie metaboliche7,8. Tuttavia, le terapie con RNA a commutazione di giunzione devono ancora essere esplorate.

Parallelamente all’aumento globale dell’obesità, la steatosi epatica associata al metabolismo (MAFLD) è diventata la patologia epatica non trasmissibile più diffusa9. La MAFLD varia dalla steatosi epatica presintomatica (fegato grasso) alla steatoepatite non alcolica, che è caratterizzata da infiammazione, danno epatocellulare e fibrosi e può progredire fino a insufficienza epatica, cirrosi e carcinoma epatocellulare (HCC)10.

Sebbene gli esatti meccanismi che promuovono la progressione della steatosi in steatoepatite non alcolica non siano completamente compresi, le prove suggeriscono che la sovranutrizione cronica e le diete ipercaloriche di tipo occidentale contribuiscono alla disregolazione delle specie lipidiche bioattive e/o tossiche, come fosfolipidi, acidi grassi saturi , sfingomieline, ceramidi e colesterolo11,12,13. Inoltre, vi sono prove che la MAFLD contribuisce alla patogenesi del diabete di tipo 2 e delle malattie cardiovascolari, essendo la malattia coronarica la principale causa di morte in questi pazienti14,15. Comprendere come la MAFLD sia collegata all’aumento del rischio cardiovascolare e al progressivo danno epatico aiuterà a identificare nuovi bersagli terapeutici.

Qui troviamo che i componenti del meccanismo AS pre-mRNA sono regolati selettivamente da input metabolici nel fegato. Identifichiamo l'omologo 2 di fox-1 legante l'RNA (RBFOX2) come un fattore di splicing chiave nel fegato, che regola l'AS in un cluster di geni coinvolti nell'omeostasi dei lipidi, tra cui il recettore scavenger di classe B tipo I (Scarb1), la fosfolipasi A2 gruppo VI ( Pla2g6), l'adattatore della vescicola di clatrina Numb, un componente del sistema di traffico di vescicole COPII Sec31a e la proteina simile 9 legante l'ossisterolo (Osbpl9). Riveliamo che RBFOX2 regola l'AS in risposta alle diete obesogene e che la rete AS regolata da RBFOX2 può essere presa di mira terapeuticamente. Gli oligonucleotidi di commutazione di giunzione (SSO) che modulano lo splicing di Scarb1 ripristinano l'accumulo di specie lipotossiche negli epatociti di topo carenti di RBFOX2, alleviano l'infiammazione del fegato associata all'obesità indotta dalla dieta in vivo e promuovono un profilo lipoproteico anti-aterogenico nel sangue, dimostrando il potenziale di terapie con RNA isoforma-specifici per patologie metaboliche.

TTACTGACCGTACACCAAATTTGCCTGC and CreR1>CCTGGCAGCGATCGCTATTTTCCATGAGTG, Rbfox2F1> AACAAGAAAGGCCTCACTTCAG and Rbfox2R1>GGTGTTCTCTGACTTATACATGCAC. All in vivo work was approved by the animal welfare and ethical review board at Imperial College London and in accordance with the United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act (1986)./p>

100 and an isolation specificity >0.7 were used for quantification. Each TMT was normalized to the total signal in each column. To allow the comparison of both TMT, those proteins quantified in both TMT, data were normalized using the bridge channels present in each TMT. Quantifications included in Supplementary Table 1 are represented as relative abundances. Newly generated proteomic datasets are publicly available as described below./p> 8, was performed and libraries were prepared using the NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina and multiplexed using NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (NEB, E7760S and E7335S). Sequencing was carried out with 100 basepair paired end reads with HiSeq 2500 (Illumina). Newly generated RNA-seq datasets are publicly available as described below. Previously published datasets of mice fed a HFr diet were obtained from GSE123896 (ref. 16). Data were processed using RTA v.1.18.54, with default filter and quality settings. The reads were demultiplexed with CASAVA v.2.17. Reads were aligned to Ensembl mouse genome (GRCm38) using Tophat2 (v.2.0.11)61 with the argument ‘–library-type fr-firststrand’. Reference sequence assembly and transcript annotation were obtained from Illumina iGenomes (https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.html). Gene-based read counts were obtained using featureCounts function from Rsubread Bioconductor package62. Normalization and differential expression analysis were performed using DEseq2 (ref. 63) or edgeR-voom-limma64,65,66,67 bioconductor packages. AS was primarily analysed with rMATs68. Differentially spliced sites were kept for data visualization if they passed the following threshold: P < 0.05; FDR < 0.1 and absolute(IncLevelDifference) >0.1 or <-0.1. Gene ontology analysis was carried out by using GOseq Bioconductor package69. A list of differentially expressed genes with adjusted P value of less than or equal to 0.05 were selected as input for the ingenuity pathway analysis (http://www.ingenuity.com/index.html). No cut-off was applied for fold change of differential expression. Enrichment of binding motifs for different splicing factors were tested using the binomTest function from the edgeR bioconductor package70./p>$OUTPUT.adapterTrim.fastq 2 > $OUTPUT.adapterTrim.metrics’./p>

0.2/p>