Basi strutturali delle modalità di legame dei ligandi dell'EAAT2 umano

Nature Communications volume 13, numero articolo: 3329 (2022) Citare questo articolo

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Nel sistema nervoso centrale (SNC), i trasportatori di aminoacidi eccitatori (EAAT) mediano l'assorbimento del neurotrasmettitore eccitatorio glutammato e mantengono le sue basse concentrazioni nella fessura sinaptica per evitare la citotossicità neuronale. La disfunzione degli EAAT può portare a molte malattie psichiatriche. Qui riportiamo le strutture crio-EM dell'EAAT2 umano in una conformazione rivolta verso l'interno, in presenza di substrato glutammato o inibitore selettivo WAY-213613. Il glutammato è coordinato da estesi legami idrogeno e ulteriormente stabilizzato da HP2. L'inibitore WAY-213613 occupa una tasca di legame simile a quella del substrato glutammato. Dopo l'associazione con WAY-213613, HP2 subisce un sostanziale cambiamento conformazionale e, a sua volta, stabilizza il legame dell'inibitore formando interazioni idrofobiche. Esperimenti elettrofisiologici chiariscono che l'esclusivo S441 gioca un ruolo chiave nel legame di hEAAT2 con glutammato o WAY-213613, e il cluster I464-L467-V468 agisce come un determinante strutturale chiave per l'inibizione selettiva di questo trasportatore da parte di WAY-213613.

Il glutammato è il neurotrasmettitore eccitatorio predominante, che svolge un ruolo chiave nello sviluppo del sistema nervoso centrale dei mammiferi e partecipa alle normali funzioni cerebrali, come l'integrazione dell'apprendimento, della cognizione e della memoria1. Inoltre, un eccesso di glutammato può portare ad eccitotossicità, che può uccidere le cellule neuronali attraverso un’eccessiva stimolazione dei recettori del glutammato2. Pertanto, è fondamentale mantenere basse concentrazioni di glutammato nei fluidi extracellulari. Gli EAAT sono noti come trasportatori di aminoacidi eccitatori che includono cinque sottotipi (EAAT1-EAAT5), che sono responsabili della rimozione del glutammato dalla fessura sinaptica legando e trasportando rapidamente i glutammati nella pre-sinapsi o negli astrociti, il che contribuisce alla terminazione dell’attività sinaptica e alla clearance del glutammato extracellulare potenzialmente citotossico3. Tra i cinque EAAT, l'EAAT2 umano (hEAAT2) è espresso prevalentemente negli astrociti ed è stato segnalato come responsabile del 90-95% dell'assorbimento di glutammato nel proencefalo mediante un meccanismo di ascensore3,4. Pertanto, hEAAT2 può mantenere il glutammato extracellulare a bassi livelli nella fessura sinaptica, che è uno degli EAAT più importanti per proteggere i neuroni5,6. La carenza di hEAAT2 provoca morte neuronale progressiva e malattie psichiatriche o neurologiche, tra cui disturbo depressivo maggiore, epilessia, morbo di Alzheimer, ictus, morbo di Parkinson e sclerosi laterale amiotrofica (SLA), e quindi hEAAT2 rappresenta un potenziale bersaglio terapeutico6,7,8.

Gli EAAT sono strutturalmente simili all'omologo archeologico GltPh, che sono tutti omotrimeri composti da tre protomeri identici9,10. Il singolo protomero ha otto eliche transmembrana (TM 1–8) e due anelli a forcina (HP) organizzati in due domini: il dominio dell'impalcatura comprende TM1, 2, 4 e 5, che è responsabile della stabilizzazione del dominio di trasporto; il dominio di trasporto comprende TM 3, 6, 7 e 8, HP1 e HP2. Studi precedenti hanno dimostrato che la subunità individuale negli EAAT può trasportare il substrato in modo indipendente11,12,13 e il sito di legame del substrato è costituito dalla regione centrale svolta di TM7 (motivo NMDGT), TM8 e dalle punte di HP1 e HP23,9.

Le strutture degli omologhi archeologici (GltPh4,9,10,14,15,GltTk16,17,18) e quattro trasportatori SLC1 umani (hEAAT119, hEAAT320, hASCT121 e hASCT222,23,24,25) sono state risolte e condividono conservazione di sequenze elevate nella tasca di legame del ligando, inclusi TM7, TM8, HP1 e HP2. Tuttavia, è ancora desiderabile determinare la struttura di hEAAT2, poiché condivide identità di sequenza basse con questi omologhi (identità di sequenza 34% con GltPh e GltTk, identità di sequenza 50% con hEAAT1 e hEAAT3, identità di sequenza 42% e 39% con hASCT1 e hASCT2, rispettivamente). WAY-213613 è un inibitore potente e altamente selettivo per hEAAT2 (IC50 è 85 nM), che ha un'affinità di 59 e 44 volte rispetto a quelli di hEAAT1 e hEAAT3 (IC50 è 5 e 3,8 μM, rispettivamente)26. Tuttavia, il meccanismo con cui WAY-213613 inibisce in modo altamente selettivo il trasporto del glutammato da parte di hEAAT2 rimane sfuggente.