Doppie emulsioni come massimo

Comunicazioni ISME volume 3, articolo numero: 47 (2023) Citare questo articolo

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La nostra comprensione della fisiologia microbica in situ si basa principalmente sulla caratterizzazione fisiologica di microbi a crescita rapida e facilmente isolabili. Gli arricchimenti microbici per ottenere nuovi isolati con tassi di crescita più lenti o fisiologie adattate ad ambienti poveri di nutrienti sono afflitti da pregiudizi intrinseci per le specie a crescita più rapida quando si utilizzano protocolli di isolamento standard di laboratorio. Sono necessari nuovi strumenti di coltivazione per ridurre al minimo questi pregiudizi e arricchire i taxa meno studiati. In questo studio, abbiamo sviluppato una piattaforma di arricchimento batterico ad alto rendimento basata sull'incapsulamento di singole cellule e sulla crescita all'interno di doppie emulsioni (GrowMiDE). Abbiamo dimostrato che GrowMiDE può coltivare molti microrganismi diversi e arricchire taxa sottorappresentati che non vengono mai osservati negli arricchimenti batch tradizionali. Ad esempio, impedire la dominanza dell'arricchimento da parte di microbi a crescita rapida a causa della privatizzazione dei nutrienti all'interno delle goccioline della doppia emulsione ha consentito la coltivazione di Negativicutes e Metanobatteri a crescita più lenta da campioni di feci in colture di arricchimento con terreni ricchi. Negli esperimenti di competizione tra tasso di crescita e ceppi specializzati in resa di crescita, gli arricchimenti GrowMiDE hanno impedito la competizione per i pool di nutrienti condivisi e si sono arricchiti per ceppi a crescita più lenta ma più efficienti. Infine, abbiamo dimostrato la compatibilità di GrowMiDE con lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) commerciale per ottenere isolati dagli arricchimenti GrowMiDE. Insieme, GrowMiDE + DE-FACS costituisce una nuova e promettente piattaforma di arricchimento ad alto rendimento che può essere facilmente applicata a diversi arricchimenti o screening microbici.

La nostra comprensione della fisiologia microbica si basa in gran parte su studi che utilizzano microbi isolati in colture pure. Le tecniche per isolare nuovi microbi negli ultimi 140 anni implicano la ricreazione in laboratorio di un ambiente favorevole e un flusso di nutrienti che imitano le condizioni naturali e quindi il tentativo di recuperare le nuove specie coltivate. Di conseguenza, i metodi attuali sono intrinsecamente sbilanciati verso i microbi a crescita rapida che possono superare altre specie per i nutrienti condivisi, anche specie con piccole differenze nel tasso di crescita massimo (μMax) (Fig. S1–S3) [1, 2]. Le specie mancanti a crescita lenta potrebbero avere strategie fisiologiche sconosciute per adattarsi al loro ambiente naturale e che probabilmente svolgono un ruolo critico nella resilienza della comunità [3]. Ad esempio, l'efficienza della crescita (resa di crescita) rispetto ai tassi di crescita è stata suggerita come strategia di sopravvivenza in ambienti a basso flusso di nutrienti o strutturati spazialmente, compresi i biofilm [1, 2, 4] e l'ambiente del sottosuolo marino (~30% della biomassa terrestre) [5,6,7,8]. Un'ulteriore sfida non banale è quella di creare un ambiente chimico adatto che supporti la crescita di diversi stili di vita microbici (ad esempio oligotrofi o copiotrofi). Pertanto, esiste la necessità fondamentale di sviluppare nuovi strumenti di coltivazione che riducano al minimo il pregiudizio per i tassi di crescita microbica rapidi.

I metodi tradizionali che limitano la competizione per risorse limitate (ad esempio, mediante la privatizzazione dei nutrienti) si basano tipicamente sulla separazione spaziale e includono la diluizione fino all'estinzione o la placcatura per le unità formanti colonie [9, 10]. Tuttavia, queste tecniche dipendono dall’abbondanza di cellule, sono a bassa produttività e non favoriscono il recupero dei microbi che crescono scarsamente alle interfacce aria-liquido, in particolare gli anaerobi [11, 12]. Gli approcci microfluidici delle goccioline sono emersi come una potente tecnica ad alto rendimento per coltivare nuovi microrganismi in bioreattori isolati, ciascuno con distribuzioni precise di reagenti necessari per la crescita [10, 13,14,15,16], facilitando gli screening per le resistenze agli antibiotici [13, 17, 18] e misurazioni dell'attività cellulare [19,20,21]. La maggior parte degli approcci microbiologici con goccioline utilizzano gocce di emulsione singola, in cui goccioline acquose contenenti cellule e mezzo sono sospese all'interno di una fase oleosa. Molti studi hanno dimostrato l'utilità della microfluidica a goccia singola in emulsione per l'indagine della diversità microbica [21,22,23,24], ottenendo genomi di alta qualità [25] e schermi funzionali [10, 13, 16, 18]. Le tecniche di arricchimento con emulsione singola hanno anche dimostrato la selezione di ceppi che hanno rese di crescita elevate o tassi di crescita più lenti, fungendo da prova di concetto per l’impatto della privatizzazione dei nutrienti sui risultati dell’arricchimento [26]. Tuttavia, le singole goccioline di emulsione richiedono apparecchiature personalizzate per l'analisi a valle e sono state selezionate solo in dimostrazioni di prova con velocità di selezione lente e canali di fluorescenza limitati [27, 28], rendendole difficili da applicare a nuovi sistemi.