Da un genoma - Foshan Mining Labs Group Co., Ltd

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 277 (2023) Citare questo articolo

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Ampliare l’arsenale di approcci profilattici contro SARS-CoV-2 è della massima importanza, in particolare quelle strategie resistenti alla deriva antigenica in Spike. Qui, abbiamo condotto uno schermo di oltre 16.000 trigger RNAi contro il genoma SARS-CoV-2, utilizzando un’analisi massicciamente parallela per identificare siRNA iperpotenti. Abbiamo selezionato dieci candidati per la validazione in vitro e trovato cinque siRNA che mostravano un'attività iperpotente (IC50 <20 pM) e un forte blocco dell'infettività negli esperimenti con virus vivi. Abbiamo ulteriormente migliorato questa attività mediante accoppiamento combinatorio dei candidati siRNA e identificato cocktail attivi contro più tipi di varianti problematiche (VOC). Abbiamo quindi esaminato oltre 2.000 possibili mutazioni nei siti bersaglio dei siRNA utilizzando la mutagenesi a saturazione e abbiamo confermato un'ampia protezione del cocktail principale contro le varianti future. Infine, abbiamo dimostrato che la somministrazione intranasale di questo cocktail di siRNA attenua efficacemente i segni clinici e le misure virali della malattia nel modello gold standard del criceto siriano. I nostri risultati aprono la strada allo sviluppo di un ulteriore livello di profilassi antivirale ortogonale ai vaccini e agli anticorpi monoclonali.

Il Covid-19 è stata una delle peggiori pandemie del mondo nei tempi moderni. Sebbene i vaccini abbiano rappresentato un grande trionfo, vi è l’urgente necessità di espandere l’arsenale di misure preventive per affrontare alcune delle loro carenze1. In primo luogo, praticamente tutti i vaccini autorizzati prendono di mira la proteina Spike2,3, convergendo su un singolo punto di fallimento, data l’esposizione ai mutanti in fuga e alle varianti virulente emergenti4,5,6,7,8. Inoltre, poiché tutti i trattamenti con anticorpi monoclonali (mAb) prendono di mira questa stessa proteina, tali spostamenti antigenici non solo ostacolano la protezione dei vaccini, ma possono anche ridurre l’efficacia di un’ampia gamma di altri tipi di trattamento. In secondo luogo, numerosi studi hanno dimostrato che la protezione dei vaccini, anche contro le malattie gravi, in genere diminuisce entro pochi mesi, dopo la seconda9, terza10,11 o quarta dose12. In terzo luogo, recenti linee di evidenza derivate da topi e primati non umani (NHP) suggeriscono che le versioni aggiornate dei vaccini mostrano un’efficacia ridotta e possono essere soggette al peccato antigenico originale13,14, quando la prima esposizione a un virus modella l’esito delle esposizioni successive a ceppi antigenicamente correlati. Questi dati suggeriscono l’utilità limitata degli aggiornamenti dei vaccini per le varianti emergenti di preoccupazione (VoC). In quarto luogo, i farmaci antivirali come Paxlovid non sono riusciti a proteggere gli adulti dall’esposizione al COVID-19. Infine, diversi studi dimostrano costantemente che è difficile ottenere un’elevata protezione negli individui immunocompromessi, anche dopo somministrazioni ripetute15, il che implica che gli individui che hanno maggiormente bisogno di un vaccino sono quelli che hanno meno probabilità di trarne beneficio. Infine, le infezioni negli individui immunocompromessi possono avere una durata prolungata16,17, il che aumenta il rischio di iperevoluzione e la comparsa di VoC, imponendo così gravi rischi per la salute pubblica.

Sostenuti dal successo di numerosi studi precedenti in cui i piccoli RNA interferenti (siRNA) venivano effettivamente utilizzati come antivirali18,19,20,21, abbiamo immaginato che i siRNA somministrati per via intranasale (in) sarebbero stati particolarmente adatti come misura di potenziamento del vaccino per le infezioni di il tratto respiratorio superiore, dove possono essere utilizzati per mitigare la trasmissione.

A tal fine, abbiamo esaminato oltre 16.000 fattori scatenanti dell’interferenza dell’RNA (RNAi) mirati al genoma della SARS-CoV-2 al fine di identificare candidati iperpotenti. Lo schermo si basava su un test massivamente parallelo, Sens.AI, che impiega un sistema di biologia sintetica per ricapitolare l’attività di silenziamento di ciascun candidato siRNA contro il virus. Nei nostri studi precedenti22,23 abbiamo utilizzato una versione precedente di Sens.AI per identificare siRNA iperpotenti contro HIV e HCV. Tuttavia, il progetto precedente era inefficiente e richiedeva più di 6 mesi per essere portato a termine. Nel nuovo progetto, abbiamo inventato un metodo più rapido che migliora il rapporto segnale-rumore utilizzando l'apprendimento statistico al posto di laboriosi passaggi sperimentali. Ampie analisi computazionali ed esperimenti in vitro hanno prodotto un cocktail di due candidati siRNA iperpotenti, che si sono rivelati efficaci contro tutti i ceppi virali testati. Finalmente. la somministrazione intranasale di questo cocktail di siRNA è stata confermata efficace nel modello di criceto siriano di SARS-CoV-2.

1.4uM). Overall, these results show that our novel genome-wide screening method identifies hyper-potent siRNAs within a single cycle./p>95%. Interestingly, both S8 and S10 showed weak responses, at the level of ~10% SARS-CoV-2 inhibition compared to the control siRNA, despite very high potency in the reporter assay (IC50 < 20 pM). However, unlike the other siRNA candidates, these two target the virus's negative strand, which is an intermediary in the replication process. Therefore, we hypothesised that targeting this intermediary RNA molecule likely would not interfere with viral replication. To further confirm our top candidates, we assessed the effect on live virus infectivity in cells using TCID50 assay (Fig. 3b). Again, we found a strong inhibitory activity of the top three out of four siRNAs, with viral repression exhibiting approximately two orders of magnitude compared to the GFP siRNA control. We next used the same settings to test five of the most potent siRNAs from the open-source discovery method (Supplementary Table 3). Only one candidate, Hel14, displayed repression levels of the viral load by >95%, on par with the levels exhibited by the top siRNAs from our Sens.AI screen (~90% inhibition) (Fig. 3c)./p>95% repression) (Fig. 3f). Interestingly, S5 was tolerant and showed efficacy against the Delta strain despite the fact that it possesses a mutation in position 14 of its target site. Second, we tested the S5/Hel14 cocktail against Omicron BA.1 using a similar setting. Similar to other reports33, the Omicron variant did not replicate as fast as other VoCs in vitro. Since these lower replication rates reduced the dynamic range of our assays, we added two positive controls, chloroquine and molnupiravir, both of which demonstrated as potent inhibitors of Omicron BA.1. The activity of the S5/Hel14 cocktail was indeed diminished in the Omicron variant. Nevertheless, it inhibited viral replication to a similar level as was induced by the positive control treatments (Fig. 3g). This finding suggested that the more modest inhibition was likely the result of a lower dynamic range due to slow viral replication, rather than due to reduced potency of the RNAi cocktail itself. Finally, we tested the activity of the cocktails against our novel replicon system, which recapitulated the function, but not infectivity of the Beta SARS-CoV-2 strain34. Consistently, the cocktails repressed the replicon by 10-15 fold, indicating that they confer a robust inhibition profile across diverse VoCs34. Importantly, analysis of high throughput sequencing data showed that cells that were treated with the S3/S5 cocktail exhibited a specific profile of depletion of reads at the siRNA cleavage sites (Fig. 3h). These data provide mechanistic support to confirm that the observed reduction in viral load was directly related to siRNA silencing./p>51% reduction in this score. Based on previous studies, the former mutation type is seven times more common than the latter36, suggesting that S5 could tolerate to some extent the more prevalent type of double mutations in the target site./p>7% weight loss at Day 5 postinfection, consistent with previous studies38,39,40. The siRNA-treated group benefited from significant protection against weight loss compared to this negative control group (p < 0.05; bootstrap hypothesis testing and Bonferroni adjusted) (Fig. 5b). This weight loss was statistically indistinguishable from the positive control group that was treated with bamlanivimab. In addition, we observed an order of magnitude suppression of viral load in the lungs of the active treatment group (Day 5) compared to the negative control, as measured by qPCR measurement of the RdRP gene (ΔVLlung = 10.3x, plung < 0.001; bootstrap hypothesis testing and Bonferroni adjusted) (Fig. 5c). Similarly, we also observed a significant suppression, albeit to a lesser extent, of viral load in the nares (ΔVLlung = 2.5x, plung < 0.05; bootstrap hypothesis testing and Bonferroni adjusted) (Fig. 5d). In both cases, the antibody was more effective than the siRNA treatment, suggesting that additional dose optimization studies are required in order to fully develop the siRNA cocktail into a viable prophylactic./p>